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A cura di Peter Palese, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, e approvato l'11 aprile 2021 (ricevuto per la revisione l'8 marzo 2021)

Abbiamo analizzato i dati dello screening COVID-19 basato sulla saliva distribuito nel campus dell'Università del Colorado Boulder. Il nostro set di dati è unico in quanto tutti gli individui SARS-CoV-2 positivi non hanno riportato sintomi al momento della raccolta della saliva e quindi erano infetti ma asintomatici o presintomatici. Abbiamo scoperto che 1) la distribuzione delle cariche virali osservata nella nostra popolazione universitaria asintomatica era indistinguibile da quanto riportato nelle popolazioni ospedalizzate; 2) indipendentemente dallo stato sintomatico, circa il 50% degli individui risultati positivi per SARS-CoV-2 sembra essere in fasi non infettive dell'infezione; e 3) solo il 2% degli individui infetti trasporta il 90% dei virioni che circolano all'interno delle comunità, fungendo da "supercarrier" virali e probabilmente anche da superdiffusore.

Analizziamo i dati degli sforzi di risposta alla pandemia dell'autunno 2020 presso l'Università del Colorado Boulder, dove sono stati testati più di 72.500 campioni di saliva per la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) utilizzando qRT-PCR. Tutti i campioni sono stati raccolti da individui che non hanno riportato sintomi associati a COVID-19 il giorno della raccolta. Da questi sono stati identificati 1.405 casi positivi. La distribuzione delle cariche virali all'interno di questi individui asintomatici era indistinguibile da quanto precedentemente osservato negli individui sintomatici. Indipendentemente dallo stato sintomatico, circa il 50% degli individui che risultano positivi per SARS-CoV-2 sembra essere in fasi non infettive della malattia, in base al fatto di avere basse cariche virali in un intervallo da cui raramente è stato isolato il virus vivo. Troviamo che, in un dato momento, solo il 2% degli individui porta il 90% dei virioni che circolano all'interno delle comunità, fungendo da "supercarrier" virali e forse anche da superdiffusore.

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è un nuovo coronavirus emerso nella popolazione umana alla fine del 2019 (1), presumibilmente da serbatoi animali (2, 3). Durante la conseguente pandemia mondiale, già più di 3 milioni di vite sono state perse a causa del virus. Finora la diffusione di SARS-CoV-2 è stata estremamente difficile da contenere. Una delle ragioni principali di ciò è che sia gli individui presintomatici che quelli asintomatici infetti possono trasmettere il virus ad altri (4⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –13). Inoltre, sta diventando chiaro che alcuni individui giocano un ruolo chiave nel seminare eventi di superdiffusione (14⇓ ⇓ –17). Qui abbiamo analizzato i dati di un vasto programma di sorveglianza universitaria. La carica virale è stata misurata nella saliva, che ha dimostrato di essere un biocampione accessibile e affidabile in cui identificare i portatori di questo patogeno respiratorio e il mezzo più probabile per la trasmissione di SARS-CoV-2 (18⇓-20). Il nostro set di dati è unico in quanto tutti gli individui SARS-CoV-2 positivi non hanno riportato sintomi al momento della raccolta della saliva e quindi erano infetti ma asintomatici o presintomatici. Scopriamo che la distribuzione delle cariche virali SARS-CoV-2 nel nostro campus è indistinguibile da quanto precedentemente osservato in individui sintomatici e ricoverati. Sorprendentemente, questi set di dati dimostrano differenze drammatiche nei livelli virali tra gli individui, con una piccolissima minoranza degli individui infetti che ospita la stragrande maggioranza dei virioni infettivi.

Abbiamo analizzato i dati risultanti dai test SARS-CoV-2 eseguiti nel campus dell'Università del Colorado Boulder durante il semestre accademico autunnale del 2020 (dal 27 agosto all'11 dicembre 2020). I residenti dei dormitori sono stati testati settimanalmente e diversi siti di test del campus sono stati operativi per tutto il semestre, offrendo test per qualsiasi affiliato del campus. Al momento della raccolta della saliva, ai partecipanti è stato chiesto di confermare che i sintomi non erano presenti; pertanto, tutte le persone infette identificate attraverso questo test di sorveglianza erano asintomatiche o presintomatiche al momento della raccolta della saliva. Va notato che tutti i campioni qui analizzati sono stati raccolti prima che la variante B.1.1.7 ("UK") SARS-CoV-2, e le successive varianti importanti, fossero documentate per la prima volta negli Stati Uniti durante le ultime settimane del 2020 e l'inizio del 2021 (21).

Durante il semestre autunnale 2020, più di 72.500 campioni di saliva sono stati sottoposti a screening per SARS-CoV-2. È stato utilizzato un saggio qRT-PCR, con lo stampo proveniente dall'aggiunta diretta di saliva senza purificazione dell'RNA (22). Tre set di primer/sonda TaqMan sono stati utilizzati in una reazione multiplex diretta contro due regioni del genoma SARS-CoV-2 (CU-E e CU-N, dove CU sta per l'Università del Colorado) e una trascrizione dell'ospite (CU-RNaseP ) come controllo. La reazione multiplex è stata utilizzata per creare curve standard per convertire il valore Ct (soglia del ciclo) di ciascun primer impostato in carica virale (virioni per millilitro) nel campione di saliva originale (Appendice SI, Fig. S1A). Per garantire che la quantificazione della carica virale sia accurata per campioni con valori di Ct estremamente bassi (cioè carichi virali estremamente elevati), abbiamo eseguito una diluizione seriale di tre campioni di saliva con le cariche virali osservate tra le più alte del semestre e abbiamo mostrato che i valori di Ct ​​scala linearmente con il fattore di diluizione (Appendice SI, Fig. S1B).

Da oltre 72.500 campioni di saliva sottoposti a screening, sono stati identificati 1.405 campioni positivi per SARS-CoV-2. La stragrande maggioranza di questi campioni positivi proveniva da individui unici, perché gli individui con test positivi sono stati indirizzati al sistema sanitario per ulteriori test e cure. La distribuzione dei valori Ct di questi 1.405 individui, con ciascuno dei due set di primer utilizzati, è mostrata in Fig.1A. Nel complesso, la distribuzione della carica virale di SARS-CoV-2 rientra in una distribuzione log-normale centrata attorno alla media di 2,1 × 107 virioni per ml (mediana = 1,1 × 106 virioni per ml) per i primer CU-E o 5,9 × 106 virioni per ml (mediana = 2,5 × 105 virioni per ml) per i primer CU-N (Appendice SI, Fig. S3). La carica virale più alta osservata era di oltre 6 trilioni (6,1 × 1012) di virioni per ml, che è stata osservata solo in un individuo. È notevole considerare che questo individuo era nel campus e non ha riportato sintomi nel nostro sito di test. La carica virale più bassa rilevata è stata di otto virioni per millilitro. Pertanto, i test di sorveglianza dimostrano una variazione estremamente ampia della carica virale in individui infetti ma apparentemente sani (asintomatici).

Distribuzione della carica virale della saliva all'interno della nostra popolazione del campus. (A) Sono mostrate le distribuzioni delle cariche virali misurate nei 1.405 campioni positivi identificati nel campus durante il semestre autunnale del 2020. Ogni istogramma mostra i valori Ct ottenuti utilizzando primer / set di sonde TaqMan mirati al gene E ("CU-E ") o il gene N ("CU-N") di SARS-CoV-2. Gli assi orizzontali sono etichettati sia con i valori Ct che con le corrispondenti cariche virali calcolate dalla curva standard per ciascun set di primer (Appendice SI, Fig. S1A). ND denota nessun dato, poiché la carica virale è al di sotto del limite di rilevamento qRT-PCR. (B) I valori Ct risultanti dai due set di primer in A sono altamente correlati, specialmente in campioni con elevate cariche virali (valore Ct inferiore a 30). I coefficienti di correlazione di Pearson (PCC) sono mostrati all'interno e oltre il Ct = 30 cutoff arbitrario. (C) Per 105 campioni di saliva positivi per SARS-CoV-2, abbiamo eseguito qRT-PCR fianco a fianco con otto diversi set di primer comunemente usati nei test diagnostici SARS-CoV-2 (Appendice SI, Fig. S2). Qui mostriamo la stessa analisi di B, tranne che con i primer CDC che prendono di mira i geni E e N (vedi Metodi).

Per verificare che queste distribuzioni della carica virale non fossero influenzate dagli specifici primer qRT-PCR utilizzati, abbiamo determinato l'accordo tra i primer CU-N e CU-E per quanto riguarda i valori Ct prodotti dai campioni. Ci si dovrebbe aspettare che set di primer diversi producano valori Ct leggermente diversi sullo stesso campione, a causa delle differenze nell'efficienza dei primer e dell'errore di pipettaggio umano durante l'impostazione della reazione. Tuttavia, troviamo una stretta correlazione nei campioni con valori Ct <30 (coefficiente di correlazione di Pearson tra valori Ct CU-N e CU-E = 0,92), ma questa correlazione si rompe nei campioni con valori Ct più alti (Coefficiente di correlazione di Pearson tra i valori CU -N e CU-E Ct = 0,10; Fig.1B). Ad alti valori di Ct (cioè basse cariche virali), una correlazione più debole è probabilmente il risultato della stocasticità nella trascrizione inversa e/o nei cicli iniziali di PCR. Ciò è supportato da un'analisi approfondita eseguita su 105 dei campioni SARS-CoV-2 - positivi, in cui ogni campione è stato analizzato con otto diversi set di primer comunemente usati nei test diagnostici SARS-CoV-2 (Fig.1C e Appendice SI , Fig. S2). Vediamo una stretta congruenza tra i valori Ct generati con primer diversi sugli stessi campioni, specialmente a valori Ct <30. Nel complesso, poiché il set di primer CU-E ha dimostrato la massima coerenza con altri set di primer durante questo confronto approfondito (Appendice SI, Fig. S2), abbiamo utilizzato i valori Ct risultanti da questo set di primer per calcolare i carichi virali della saliva da da questo punto in avanti.

Successivamente abbiamo confrontato le cariche virali di individui nel nostro campus, che non avevano sintomi al momento della raccolta del campione, con misurazioni di carica virale simili prese nella saliva di individui sintomatici. Abbiamo esaminato i set di dati pubblicati di SARS-CoV-2 qRT-PCR derivati ​​da studi su individui ospedalizzati (e quindi sintomatici). Abbiamo specificamente cercato studi che analizzassero la saliva e in cui fossero riportate le cariche virali, poiché i valori di Ct sono specifici di laboratorio e di analisi (23). Abbiamo identificato 404 punti dati che soddisfacevano tali criteri, che abbiamo raccolto dai 10 studi elencati nell'Appendice SI, Tabella S1. Notiamo che il campionamento del nostro campus rappresenta probabilmente punti temporali medi precedenti nel corso dell'infezione rispetto a quelli dei campioni ospedalieri, che sono stati per lo più raccolti dopo l'insorgenza dei sintomi. Tuttavia, simile alla distribuzione della carica virale della popolazione asintomatica del campus (media = 2,1 × 107 virioni per ml, mediana = 1,1 × 106 virioni per ml), la carica virale nei campioni di saliva dei pazienti sintomatici mostra una distribuzione log-normale con una media di 2,5 × 107 virioni per ml (mediana = 9,4 × 105 virioni per ml) e variava da cariche virali molto elevate (9,5 × 1010 virioni per ml) a cariche virali prossime al limite di rilevabilità (1,3 virioni per ml) (Fig.2A e Appendice SI, Fig. S3). Successivamente abbiamo tracciato la distribuzione cumulativa della carica virale in entrambe le popolazioni (Fig.2B). Questo confronto rappresenta davvero due estremi: un gruppo è per lo più ricoverato in ospedale, mentre l'altro gruppo rappresenta una popolazione universitaria per lo più giovane e sana (ma infetta). Tuttavia, le distribuzioni sono estremamente simili (test di Kolmogorov − Smirnov a due code a due campioni, statistica D = 0,03, valore P = 0,97; Fig.2B). Pertanto, gli individui hanno distribuzioni simili della carica virale della saliva indipendentemente dallo stato sintomatico, come è stato osservato anche negli studi sulla carica virale nei tamponi nasali anteriori o nasofaringei (24⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –29).

Le distribuzioni della carica virale sono simili nelle popolazioni asintomatiche e sintomatiche. (A) Un istogramma della carica virale della saliva nella nostra popolazione asintomatica del campus (n = 1.405, blu) rispetto allo stesso istogramma della carica virale della saliva di individui sintomatici (n = 404, rosso). Quest'ultimo rappresenta i dati compilati dai 10 studi nell'Appendice SI, Tabella S1. Una funzione di densità di probabilità lognormale è adattata alle due distribuzioni date la media della popolazione e la deviazione standard. (B) Funzioni di distribuzione cumulativa empirica (ECDF) della carica virale della saliva nelle popolazioni asintomatiche (n = 1.405, blu) e sintomatiche (n = 404, rosso). La somiglianza dei due ECDF è stata valutata con il test di Kolmogorov − Smirnov, che ha dato statistica D = 0,03 e valore P = 0,97.

Successivamente abbiamo analizzato come il virus è distribuito tra gli individui all'interno delle popolazioni. Sommando la carica virale tra gli individui in base alla funzione di densità di probabilità interpolata che rappresenta ciascuna popolazione, a partire da quelle con le cariche virali più elevate, troviamo che solo il 2% degli individui ospita il 90% dei virioni circolanti (Fig. 3). Questo è vero sia nella popolazione universitaria (cioè asintomatica) sia in quella ospedaliera (cioè sintomatica). Inoltre, il 99% dei virioni circolanti in comunità è rappresentato solo dal 10% della popolazione asintomatica e dal 14% della popolazione sintomatica. Sia nella popolazione asintomatica che in quella sintomatica, un singolo individuo con la più alta carica virale salivare portava più del 5% del totale dei virioni circolanti. D'altra parte, tutti gli individui con carica virale salivare inferiore a 106 virioni per ml combinati (che rappresentano 50% degli individui infetti) ospitano meno dello 0,02% dei virioni in entrambe le popolazioni. Questo può essere compreso perché Ct è una rappresentazione lineare degli aumenti logaritmici della carica virale, per cui la carica virale aumenta esponenzialmente al diminuire del valore Ct (Appendice SI, Fig. S1). Pertanto, esiste una distribuzione altamente asimmetrica dei virus all'interno di entrambe le popolazioni, con solo un piccolo numero di persone che trasportano la stragrande maggioranza del virus. Rimane sconosciuto se si tratti di individui speciali in grado di ospitare cariche virali straordinariamente elevate, o se molti individui infetti passano attraverso un periodo di tempo molto breve di carica virale estremamente elevata (vedere l'ulteriore discussione di seguito). Indipendentemente dal meccanismo, è tuttavia vero che, in un dato momento, un piccolo numero di persone ospita la stragrande maggioranza dei virioni.

Una piccola percentuale di individui sono supercarrier virali. Gli istogrammi mostrati (asse y destro) sono gli stessi mostrati in Fig. 2. Partendo dalla sinistra di ciascun istogramma (cioè quegli individui con la carica virale più alta), abbiamo calcolato la percentuale cumulativa dei virioni totali in funzione di carica virale salivare in base alla funzione di densità di probabilità della distribuzione (linee blu e rosse e asse y sinistro). Sia nelle popolazioni asintomatiche (linea blu) che sintomatiche (linea rossa), la porzione di popolazione che ospita il 90% e il 99% del virus circolante è evidenziata dalle linee tratteggiate. Stimiamo che solo il 50% circa (51% e 42% nei pannelli mostrati) degli individui risultati positivi al virus presenti effettivamente virioni infettivi, sulla base dell'osservazione che il virus vivo è stato raramente isolato da campioni con carica virale <106 virioni per ml (28, 30⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –35). Per contesto, viene mostrata la gamma di limiti di rilevamento dei comuni paradigmi di test diagnostici SARS-CoV-2 (qRT-PCR, test dell'antigene e amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa). Tutti i paradigmi di test cattureranno praticamente tutti gli individui e i virioni infettivi, sia nelle popolazioni presintomatiche che in quelle sintomatiche. I limiti di rilevamento sono presi dai rif. da 50 a 52.

Raramente i virioni infettivi sono stati isolati da campioni clinici di individui con carica virale inferiore a 106 virioni per ml (28, 30⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –35). Un'ipotesi è che le persone in questa bassa gamma di carica virale possano semplicemente perdere genomi virali da tessuto danneggiato che è in fase di riparazione e, per questo motivo, potrebbero non rappresentare un rischio sostanziale di infettare gli altri. Le nostre distribuzioni suggeriscono che circa la metà delle persone che risultano positive potrebbe non essere contagiosa per gli altri (Fig. 3), sulla base di questa linea di ragionamento.

Una scoperta importante qui è che la stragrande maggioranza dei virioni circolanti nelle comunità si trova all'interno dei corpi di un piccolo numero di individui. Questi risultati confermano tendenze simili osservate altrove (14⇓ ⇓ –17, 25). Sebbene resti da vedere esattamente come la probabilità di trasmissione sia correlata alla carica virale, una forte implicazione è che questi individui che sono supercarrier virali possono anche essere super diffusori. È stato dimostrato che cariche virali più elevate aumentano la probabilità di trasmissione ad altri in Cina (36), in Spagna (37) e tra coppie di coinquilini nel nostro campus universitario (38). Un tasso più elevato di diffusione da parte dei supercarrier virali sarebbe coerente con le recenti analisi di tracciamento dei contatti che suggeriscono che l'80-90% delle infezioni è causato dal 10-20% degli individui infetti (14⇓ ⇓ -17). Un più alto tasso di diffusione da parte dei supercarrier virali sarebbe anche coerente con i tassi di trasmissione sorprendentemente bassi riportati tra coinquilini (38), compagni di scuola (39, 40) e membri della famiglia (41), che potrebbero essere spiegati se solo una piccola frazione di gli individui infetti hanno cariche virali sufficientemente elevate da facilitare la trasmissione attiva.

Una possibile spiegazione per le differenze di carica virale tra gli individui è che gli individui sono stati semplicemente testati in diverse fasi di infezioni virali altrimenti simili. Tuttavia, le analisi longitudinali delle singole infezioni mostrano che i picchi di carica virale variano notevolmente tra gli individui (42⇓ -44). Quindi, la spiegazione parsimoniosa è che gli individui producono diversi livelli di virus. Resta da determinare se ciò sia dovuto alla variazione della risposta immunitaria, alla variazione nei fattori dell'ospite che supportano la replicazione del virus come ACE2, la specifica variante virale infettante o il sito o la dose di infezione iniziale (45⇓ ⇓ –48). Per esaminare ulteriormente questo aspetto, abbiamo confrontato le distribuzioni della carica virale analizzate qui con una distribuzione normale teorica utilizzando grafici quantile - quantile (Appendice SI, Fig. S3). I dati si discostano dalla normale distribuzione agli estremi, anche nella parte della popolazione con le più alte cariche virali. Ciò è coerente con l'ipotesi che una piccola percentuale di individui rappresenti un'unica popolazione con diversa capacità di infezione rispetto al resto della popolazione.

La concentrazione della maggioranza del virus in una piccola frazione della popolazione in un dato momento è un'osservazione critica con conclusioni attuabili. Lo screening comunitario per identificare i supercarrier virali negli stadi presintomatici e asintomatici della malattia sarà importante, poiché questi individui continueranno a sostenere e guidare l'epidemia se non vengono localizzati. Trovare supercarrier virali avrà un impatto sproporzionatamente grande sulla riduzione delle nuove infezioni da COVID-19, tuttavia gli individui senza sintomi non tendono a cercare test, quindi lo screening dovrà mirare a popolazioni sane. Gli approcci di modellazione mostrano che uno dei fattori più importanti nello screening per SARS-CoV-2 sarà la velocità con cui le persone infette riceveranno i risultati del test (noto anche come tempo di risposta) (49). Più tempo impiegano le persone a ricevere i loro risultati, più passa il tempo in cui potrebbero infettare inconsapevolmente gli altri. Pertanto, è imperativo trovare supercarrier di virus e informarli del loro stato di infezione in modo rapido, facile e accessibile. Sebbene i limiti di rilevamento varino tra il monitoraggio e gli attuali paradigmi diagnostici, tutti sono più che in grado di trovare la maggior parte degli individui infetti e la stragrande maggioranza dei virioni circolanti (Fig. 3) (50⇓ –52).

Per la raccolta di campioni condotta presso la nostra università, è stato chiesto agli individui di compilare un questionario (https://www.colorado.edu/daily-health-form) per confermare che non presentavano sintomi coerenti con COVID-19 e per raccogliere non meno di 0,5 ml di saliva in una provetta di raccolta con tappo a vite da 5 ml. I campioni di saliva sono stati riscaldati a 95 ° C per 30 minuti in loco per inattivare le particelle virali per una manipolazione più sicura e quindi posti su ghiaccio o a 4 ° C prima di essere trasportati al laboratorio di analisi per l'analisi qRT-PCR lo stesso giorno.

Per l'analisi qRT-PCR, il team di test dell'università ha trasferito 75 μL di saliva in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in cui ciascun pozzetto era stato precaricato con 75 μL di tampone 2 × Tris/borato/acido etilendiamminotetraacetico (TBE) integrato con l'1% Tween-20. Di questo campione diluito, 5 μL sono stati quindi aggiunti a un pozzetto di una piastra separata da 96 pozzetti in cui ciascun pozzetto era stato precaricato con 15 μL di miscela di reazione composta da TaqPath 1-Step Multiplex Master Mix (Thermo Fisher A28523), priva di nucleasi acqua e una miscela di primer triplex composta da set di primer e sonde CU-E, CU-N e CU-RNaseP (Tabella 1; le condizioni sono leggermente cambiate durante il semestre). I reagenti sono stati miscelati, centrifugati e caricati su una macchina qPCR Bio-Rad CFX96 o CFX384. La qRT-PCR è stata eseguita utilizzando la modalità standard, costituita da una fase di mantenimento (25°C per 2 min, 50°C per 15 min e 95°C per 2 min) seguita da 44 cicli di una fase PCR (95°C per C per 3 s, 55 ° C per 30 s, con una velocità di accelerazione e decelerazione di 1,6 ° C/s). I valori Ct di tutti gli sforzi di test del campus ci sono stati comunicati come dati non identificati.

I set di primer/sonda TaqMan qRT-PCR utilizzati per lo screening universitario e l'analisi mirata

Per un sottoinsieme più piccolo di 105 campioni, come descritto qui, abbiamo effettuato un confronto fianco a fianco di tre diversi saggi multiplex qRT-PCR comunemente usati nella diagnostica SARS-CoV-2. Abbiamo scongelato 105 campioni di saliva congelati e non identificati che in precedenza erano risultati positivi per SARS-CoV-2 nell'operazione di screening del campus ed eseguito tutte le seguenti analisi qRT-PCR fianco a fianco il giorno dello scongelamento del campione.

In primo luogo, 25 μL di saliva scongelata e precedentemente trattata termicamente sono stati trasferiti in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti in cui ciascun pozzetto era stato precaricato con 25 μL di tampone 2 × TBE integrato con 1% Tween-20. Successivamente, 5 μL del campione diluito sono stati aggiunti a piastre separate da 96 pozzetti in cui ciascun pozzetto era stato precaricato con 15 μL di miscela di reazione composta da TaqPath 1-Step Multiplex Master Mix (Thermo Fisher A28523), acqua priva di nucleasi e US Miscela di primer triplex dei Centers for Disease Control (CDC) o miscela di primer triplex CU (Tabella 1). I reagenti sono stati miscelati, centrifugati e caricati su una macchina qPCR Bio-Rad CFX96. La qRT-PCR è stata eseguita utilizzando la modalità standard, costituita da una fase di mantenimento (25°C per 2 min, 50°C per 15 min e 95°C per 2 min) seguita da 44 cicli di una fase PCR (95°C per C per 3 s, 55 ° C per 30 s, con una velocità di accelerazione e decelerazione di 1,6 ° C/s). Ogni piastra conteneva anche due pozzetti di modello di controllo negativo (5 μL di acqua priva di nucleasi diluita 1: 1 con 2 × TBE integrato con 1% Tween-20) e due pozzetti di modello di controllo positivo (5 μL di SARS-CoV-sintetico). 2 RNA [Twist Biosciences 102024] diluito a 1.000 copie del genoma per μL e 5 μL di RNA di riferimento umano totale [Agilent 750500] diluito a 10 ng/μL in acqua priva di nucleasi).

Abbiamo anche eseguito l'analisi SalivaDirect TaqMan qRT-PCR (20) su ciascuno di questi campioni; 75 μl di ciascun campione di saliva sono stati combinati con 9,4 μl di proteinasi K (20 mg/ml, New England Biolabs, P8107S). I campioni sono stati incubati a temperatura ambiente per 15 minuti e quindi riscaldati a 95 ° C per 5 minuti per inattivare la proteinasi K. Successivamente, 5 μL di saliva sono stati utilizzati come stampo in una reazione di 20 μL che conteneva anche 1 × TaqPath 1-Step Multiplex Master Mix, acqua priva di nucleasi e set di primer e sonde alle concentrazioni descritte di seguito. La qRT-PCR è stata eseguita sulla macchina qPCR BioRad CFX96 utilizzando lo stesso programma descritto per i saggi CU (20).

I dati sulla carica virale sui partecipanti all'università sono stati deidentificati e aggregati dallo screening operativo dell'Università del Colorado Boulder per SARS-CoV-2. Questa attività non soddisfa la definizione di ricerca su soggetti umani descritta nel codice 45 dei regolamenti federali per la salute e i servizi umani degli Stati Uniti, parte 46. Campioni di saliva non identificati (n = 105) utilizzati per il confronto incrociato dei primer sono stati raccolti secondo il protocollo 20- 0662, approvato dall'Università del Colorado Boulder Institutional Review Board.

Tutti i dati dello studio sono inclusi nell'articolo e nell'appendice SI.

Ringraziamo l'Università del Colorado Boulder per il loro approccio ambizioso e aggressivo per mantenere sicuro il nostro campus. In particolare, ringraziamo la dott.ssa Kristen Bjorkman per il suo ruolo chiave nel coordinare gli sforzi di risposta alla pandemia nel nostro campus. Ringraziamo il Dr. Dan Larremore e il Dr. Bob Grober per i preziosi consigli sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti del Coronavirus Aid, Relief, and Economic Security Act degli Stati Uniti (all'Università del Colorado), del Burroughs Wellcome Fund (Pathogenesis of Infectious Disease Award to SLS; Postdoctoral Enrichment Program Award to NRM), del NIH (Concedi DP1-DA-046108 a SLS), il Programma di biologia quantitativa interdisciplinare (a SSW) e Howard Hughes Medical Institute (a RP).

Contributi degli autori: ricerca progettata da QY, TKS, PKG, EL, CJD, NRM, GRB, MBM, RDD, LL, RP e SLS; QY, TKS, PKG, EL, CJD, KLT, MRF, CRH, JCD, CDO, DM, SKC, WTF, CLP, ARG, AB-G., ERW-S., SSW e RDD hanno eseguito ricerche; Dati analizzati QY, RDD, RP e SLS; e QY, TKS, RDD, LL, RP e SLS hanno scritto il documento.

Dichiarazione di interesse competitivo: alcuni degli autori di questo studio hanno legami finanziari con aziende che offrono test commerciali SARS-CoV-2 (QY, NRM, CLP e SLS sono cofondatori di Darwin Biosciences; TKS, PKG ed EL sono cofondatori di TUMI genomica). RP è cofondatore di Faze Medicines e RDD è cofondatore di Arpeggio Biosciences.

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