ELISA sta per saggio di immunoassorbimento enzimatico. È un metodo immunologico versatile che rientra nella categoria dei saggi immunoenzimatici. 

In questo tipo di saggio analitico, una sostanza da determinare (definita analita) si lega ad un'altra (generalmente rappresentata da un anticorpo) che ne rileva la presenza. Il metodo ELISA ha come scopo la rilevazione e l'identificazione (sia qualitativa che quantitativa) di una specifica sostanza all'interno di un campione.

Prima del suo sviluppo, l'unica opzione per condurre un test immunologico era una tecnica che utilizzasse antigeni o anticorpi marcati radioattivamente. Poiché la radioattività rappresenta una potenziale minaccia per la salute, ELISA è stata un'alternativa più sicura.

Nel 1971, Peter Perlmann ed Eva Engvall (Università di Stoccolma) e Anton Schuurs e Bauke van Weemen (Paesi Bassi) pubblicarono in modo indipendente le loro conoscenze sui metodi di esecuzione dell'EIA/ELISA.

L'immunochimica è una disciplina immunologica che mira a studiare gli antigeni, gli anticorpi e l'interazione antigene-anticorpo.

L'antigene è quella sostanza che, in opportune condizioni, è in grado di indurre la formazione di uno o più anticorpi, reagendo specificatamente con essi. Gli anticorpi sono invece sostanze di natura glicoproteica definite anche immunoglobuline o gamma globuline. La produzione di anticorpi si ottiene per differenziazione delle plasmacellule in seguito all'azione della risposta immunitaria.

L'interazione che si instaura tra antigene e corrispondente anticorpo porta alla formazione di quello che viene definito immunocomplesso (la natura del legame è non covalente e reversibile). L'analita o gli anticorpi sono marcati con una sostanza chiamata tracciante che consente il rilevamento e può essere un radioisotopo, un composto fluorescente o un enzima.

La specificità delle reazioni antigene-anticorpo e la sensibilità dei "marcatori" possono essere combinate insieme per realizzare un "test immunologico", cioè quantificare con precisione una sostanza antigenica. La tecnica più utilizzata è il radioimmunoassay (RIA), in cui il tracciante è costituito da un isotopo. Quando invece il tracciante è costituito da un enzima si parla di immunodosaggi enzimatici (EIA).

In immunochimica ci sono diversi enzimi che possono essere usati come traccianti. Tra le più note troviamo la perossidasi (HRP), una molecola classificata nel gruppo delle ossido reduttasi: viene estratta dalla radice delle piante di rafano (Cochlearia armoracia) e svolge attività antiossidante, aiutando a preservare cellule e tessuti dagli effetti nocivi delle sostanze prodotte. dall'attività ossidasi in vivo. La perossidasi agisce quindi come catalizzatore di una reazione di ossidoriduzione, in cui un substrato rilascia elettroni che ossidano un cromogeno.

Un secondo importante tracciante è la fosfatasi alcalina (nell'isoforma estratta dall'intestino di bue). Il colore si sviluppa in seguito all'idrolisi enzimatica degli esteri che compongono il substrato, che si scompongono in composti fenolici e fosfati. A questo punto i composti fenolici si combinano con il cromogeno per formare il prodotto colorato.

Il dosaggio immunologico può essere rilevato anche grazie al complesso avidina-biotina. L'avidina è una proteina presente nell'albume d'uovo, in grado di legare la biotina con elevata affinità. Quest'ultima può essere coniugata ad altre proteine ​​senza alterarne le caratteristiche e mantenendo inalterata la sua affinità per l'avidina. Quindi, queste proprietà sono fruttuose per la rilevazione colorimetrica del complesso antigene-anticorpo, dove è molto importante preservare l'integrità del legame per avere un'elevata sensibilità e specificità della reazione.

Il test ELISA si basa sull'uso di anticorpi marcati con un enzima (solitamente perossidasi), in modo che i coniugati risultanti abbiano attività sia immunologica che enzimatica. Avendo uno dei componenti (antigene o anticorpo) aderito alla piastra, la reazione antigene-anticorpo viene immobilizzata e quindi facilmente evidenziabile con l'aggiunta del substrato che, reagendo con l'enzima, produrrà un colore visibile e quantificabile con lo spettrofotometro.

Nel test ELISA diretto l'antigene viene fatto aderire alla base del supporto solido e la sua presenza può essere rilevata mediante l'utilizzo di un anticorpo marcato con un enzima che, se reagito con un opportuno substrato, consente l'osservazione di un complesso (precedentemente incolore) che ora produrrà un colore apprezzabile.

Analizzando più da vicino il metodo del sandwich diretto, per determinare la presenza di un determinato antigene in un campione biologico, è necessario seguire i passaggi consequenziali:

In generale, lo sviluppo del colore è indicativo della presenza dell'antigene da testare e l'intensità della colorazione è semiquantitativa e misurabile mediante l'uso dello spettrofotometro.

La procedura prevede l'utilizzo di un anticorpo secondario marcato in grado di riconoscere la regione costante dell'anticorpo primario, precedentemente incubato in fase solida. In questo metodo, a differenza dei precedenti descritti, è importante determinare la presenza di un anticorpo specifico.

I passi sono come segue:

L'analisi ELISA è ormai fortemente consolidata tra le tecniche di laboratorio ma non è certo infallibile.

Il vantaggio principale è l'elevata sensibilità e specificità diagnostica: può essere utilizzato per quantificare le molecole contenute in vari campioni, inclusi siero, plasma, urina, saliva o estratti di tessuto. Tramite ELISA, invece, si possono ottenere solo informazioni riguardanti la presenza o l'assenza di determinate molecole nel nostro campione: questo è un notevole svantaggio, soprattutto quando si vuole analizzare e caratterizzare biochimicamente quanto rilevato dal saggio.

Il test ELISA ha numerose applicazioni che vanno dalla diagnostica alla rilevazione delle intolleranze alimentari. In caso di intolleranza alimentare (mediata da immunoglobuline IgG) e allergia alimentare (mediata da immunoglubuline IgE), il test può essere effettuato con un semplice prelievo di sangue capillare, anche in farmacia.

L'ELISA ha sicuramente destato attenzione per la sua capacità di verificare la possibile esposizione ad uno specifico patogeno: un esempio in piena regola è il test HIV-Ab utilizzato per diagnosticare l'eventuale presenza di anticorpi anti-HIV.

Inoltre, come non citare i test sierologici volti ad individuare il nuovo contagio da coronavirus di cui tanto si sente parlare. Con la crescita degli individui infetti, infatti, diventa sempre più necessaria la fornitura di test di laboratorio che possano restituire una fotografia accurata della diffusione del virus SARSCoV2 nella popolazione.

In un momento di emergenza come quello che stiamo vivendo, lo strumento più adatto è il test sierologico quantitativo per la rilevazione degli anticorpi anti-SARS-CoV-2. I test immunologici rilevano gli anticorpi prodotti dall'organismo in risposta a un'infezione da agenti patogeni e, inevitabilmente, affrontano la variabilità intrinseca della risposta anticorpale umana, che richiede tempo per la caratterizzazione. Proprio per questo si sta discutendo sui test rapidi (test qualitativi).

Alla Regione Toscana è stato invece fornito il test ELISA, validato direttamente dallo Spallanzani di Roma e disponibile da fine aprile, che costituirà un utile complemento alla diagnosi molecolare soprattutto nel caso di soggetti asintomatici, consentendo studi epidemiologici sulla diffusione del virus da eseguire. Uno scopo importante, poiché è ormai noto che la rapida identificazione dei soggetti infetti è il primo passo per attuare misure per controllare l'ulteriore diffusione del virus tra la popolazione.

In rete è possibile trovare numerosi esempi in cui si possono osservare i vari passaggi necessari per l'esecuzione di un saggio ELISA. Ecco un video di YouTube realizzato dal canale Edvotek Inc:

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