Questo articolo è stato aggiornato per includere ulteriori informazioni sul sistema Qiagen QIAcuity.NEW YORK – Roche potrebbe essere un po' un ritardatario nello spazio della PCR digitale con il recente lancio del suo sistema Digital LightCycler, ma l'azienda punta su funzionalità come un volume di input elevato del campione, il rilevamento a sei colori e un più semplice sviluppo di test personalizzati per distinguerlo in un mercato sempre più popolato.In particolare, l'azienda punta la piattaforma verso lo spazio dell'oncologia clinica, dove le sue caratteristiche possono consentire test di rilevamento delle mutazioni altamente sensibili e multiplex per aiutare nella ricerca farmaceutica e, potenzialmente, nella guida alla terapia del paziente.Roche ha descritto per la prima volta l'ingresso di dPCR nel 2018 e all'inizio di quest'anno l'azienda ha descritto la sua aspettativa che Digital LightCycler sarebbe un attore competitivo in un mercato che ora include almeno altri quattro sviluppatori.Lanciato il mese scorso per scopi di ricerca, il sistema vanta sei canali ottici e tre diversi formati per la PCR digitale su piastra, incluso uno chiamato HiSensitivity nanowell plate che accetta 45 microlitri di campione."Continuiamo a spingere la PCR in più applicazioni", ha affermato Miriam Fend, leader del ciclo di vita dei sistemi PCR di Roche, osservando che la PCR digitale consentirà ora ai clienti dell'azienda di eseguire test PCR di precisione, con "quantificazione assoluta e sensibilità unica".Il sistema Digital LightCycler è stato sviluppato dal team di ricerca e sviluppo di Roche, ha affermato Fend, e l'azienda ha deciso di renderlo diverso dalle altre offerte commerciali.Attualmente, i sistemi disponibili in commercio includono la linea di strumenti Bio-Rad Laboratories QX Droplet Digital, il sistema Stilla Technologies Naica, il sistema Thermo Fisher Scientific QuantStudio Absolute Q Digital PCR e il Qiagen QIAcuity.Questi differiscono in aspetti come il modo in cui si formano le goccioline per la PCR, il numero di strumenti richiesti, il numero di canali ottici disponibili e il flusso di lavoro complessivo e il tempo per ottenere i risultati.Alcuni dei sistemi concorrenti utilizzano la formazione di goccioline a base di emulsione, ma il sistema Roche è a base di piastre.Fend ha affermato che ciò semplifica l'utilizzo e amplia l'accesso ai laboratori che necessitano di una maggiore standardizzazione e di un flusso di lavoro più semplice, come i laboratori clinici.Il sistema presenta un flusso di lavoro automatizzato che divide il campione in 100.000 partizioni e può produrre risultati in 1,5-3 ore, ha affermato Fend.Dispone inoltre di quello che Fend ha definito un software "intuitivo" per l'analisi dei dati e il reporting dei risultati e può essere collegato a sistemi LIS.Anche il fattore di forma è una parte fondamentale del marchio Roche, secondo Fend, e il Digital LightCycler ha l'aspetto e la sensazione di altri strumenti Roche.Inoltre, completa l'offerta dell'azienda di sistemi molecolari, coprendo lo spettro qPCR dal point-of-care Liat al Cobas 6800/8800 ad alto rendimento.Roche può ora offrire ai clienti "una suite completa di tecnologie PCR" con un "aspetto grafico e un'esperienza utente" che semplificano il passaggio da una tecnologia all'altra, ha affermato Fend.La PCR digitale ha il vantaggio di fornire la quantificazione senza richiedere fasi di calibrazione separate, il che aiuta a conservare campioni preziosi.Anche il multiplexing nei sistemi multicanale amplifica questo attributo.Un luogo in cui l'elevata precisione e il multiplexing potrebbero essere utili è il test per le mutazioni genetiche in campioni eterogenei di tumori per l'oncologia clinica.Fend ha affermato che Digital LightCycler offre tre diversi materiali di consumo per lastre, con una nuova piastra a pozzetti profondi che può potenzialmente consentire il rilevamento di bersagli a bassa concentrazione o rari utilizzando meno reazioni.Ad aprile, Roche ha presentato un poster alla riunione annuale dell'Associazione americana per la ricerca sul cancro che descrive l'uso delle capacità a sei canali del Digital LightCycler e delle piastre a pozzetti profondi per consentire un test a 43 target, a due provette per il rilevamento simultaneo delle mutazioni dell'EGFR.Il team ha notato che il test rileva se le mutazioni T790M e C797S sono in fase cis o trans nella stessa reazione e riporta anche il contesto allelico rilevando e quantificando altre mutazioni di EGFR, comprese 27 delezioni nell'esone 19 e sei inserzioni nell'esone 20.Un tale test potrebbe avere applicazioni per determinare se un paziente con cancro del polmone non a piccole cellule ha mutazioni che richiedono il passaggio agli inibitori della tirosin-chinasi di terza generazione, secondo il poster.In particolare, metà dei pazienti con TKI di prima e seconda generazione sviluppa una mutazione di resistenza T790M e può quindi passare al TKI di terza generazione chiamato osimertinib (Tagrisso di AstraZeneca).Tuttavia, questo trattamento successivo può portare all'emergere di una mutazione C797 nel gene EGFR.Se questa mutazione è in una fase trans, la combinazione di TKI di prima e terza generazione può avere alcuni vantaggi per questi pazienti.Tuttavia, non è noto se il contesto allelico generale sia importante in questo trattamento e i ricercatori di Roche hanno affermato nel poster che un pannello di mutazione multiplex dell'EGFR potrebbe quindi essere un utile strumento di ricerca.L'azienda ha riferito che il test multiplex EGFR potrebbe rilevare mutazioni a frequenze fino allo 0,1 percento in campioni di DNA privo di cellule artificiali.Un simile approccio PCR digitale è stato descritto l'anno scorso sulla rivista Cancers utilizzando il sistema a sei colori di Stilla Technologies e un test EGFR a 24 plex, a provetta singola.Roche effettua anche un test qPCR, il Cobas EGFR Mutation Test v2, che rileva un totale di 42 target ed è stato utilizzato come comparatore nello studio Stilla.Quel test è stato autorizzato dalla Food and Drug Administration statunitense per l'uso come diagnostica complementare per cinque diverse terapie TKI.Nel poster dell'AACR, i ricercatori Roche hanno confrontato il loro pannello EGFR con un test di Bio-Rad chiamato Bio-Rad Expert Design assay, che funziona sul QX200.Hanno scoperto che entrambi i test avevano prestazioni simili nel rilevare le mutazioni cis rispetto a quelle trans, ma hanno notato che il test Bio-Rad rileva solo C797S e T790M.Da notare, il sistema QX200 di Bio-Rad ha due canali ottici, mentre il sistema PCR digitale QuantStudio Absolute Q di Thermo Fisher ha quattro canali ottici con un quinto utilizzato come riferimento.Bio-Rad sta inoltre sviluppando un sistema a sei canali da 100.000 goccioline chiamato QX600.Il sistema Qiagen QIAcuity, nel frattempo, è disponibile come strumento a una piastra con due o cinque canali, e l'azienda produce anche strumenti a quattro e otto piastre in cui cinque canali sono standard, secondo un portavoce.Fend ha affermato che Roche ha anche stretto una collaborazione con MilliporeSigma per sviluppare oligonucleotidi personalizzati per i clienti che sviluppano i propri test.E, sebbene al momento l'azienda sia orientata verso applicazioni cliniche, ha notato che il sistema potrebbe essere utilizzato dai clienti anche per altre applicazioni come test delle acque reflue o controllo di qualità biofarmaceutico per cose come la produzione di terapie geniche e cellulari.Tuttavia, "il punto in cui pensiamo davvero che la PCR digitale abbia il suo più grande potenziale è spostarsi in uno spazio clinico per fornire test oncologici e di monitoraggio delle malattie, ed è qui che noi di Roche siamo davvero forti", ha affermato Fend.Mikael Kubista, fondatore e CEO di TATAA Biocenter, è tra i primi utenti del Digital LightCycler e ha testato il sistema per circa quattro mesi, ha affermato in una e-mail.TATAA Biocenter è un'organizzazione di ricerca a contratto incentrata sulla terapia cellulare e genica che lavora con la PCR digitale da oltre 15 anni e offre test dPCR come servizio da oltre 10."Abbiamo tutte le principali piattaforme dPCR che forniscono regolarmente corsi di formazione pratica alla comunità di ricerca", ha affermato Kubista.Il team è anche coautore delle linee guida dPCR MIQE per insegnare ai ricercatori come pianificare, eseguire e segnalare studi dPCR e ha anche contribuito allo standard ISO recentemente rilasciato su qPCR e dPCR, ha anche osservato.Poiché TATAA Biocenter è un laboratorio accreditato, deve eseguire test approfonditi di nuovi strumenti, convalidare le prestazioni e stabilire flussi di lavoro.TATAA li integra anche in un sistema LIS che utilizza, chiamato Benchling.Le principali applicazioni per dPCR nel laboratorio TATAA sono studi farmacodinamici e farmacocinetici, rilevamento di sequenze rare e calibrazione degli standard."Stiamo anche stabilendo procedure operative standard per la progettazione e la convalida di test dPCR personalizzati", ha affermato Kubista.In questo contesto, una "caratteristica unica e molto apprezzata" del nuovo sistema Roche dPCR per Kubista sono i suoi flussi di lavoro separati per lo sviluppo e le bioanalisi regolamentate, ha affermato."La modalità di sviluppo offre la flessibilità di cui abbiamo bisogno durante la progettazione e la convalida di saggi personalizzati per gli studi PK/PD dei clienti, mentre la modalità di bioanalisi regolamentata soddisfa i requisiti per gli studi GLP e consente un trasferimento efficiente di tecnologie e metodi quando richiesto", ha affermato.Come qualcuno che ha familiarità con altri sistemi PCR digitali disponibili in commercio, Kubista ha affermato che sono "tutti a posto", ma ci sono alcune caratteristiche distintive del sistema Roche.In particolare, le tre diverse piastre consentono l'ottimizzazione dei costi e delle prestazioni, ha affermato."La piastra ad alta sensibilità accetta un volume totale impressionante di circa 45 microlitri", ha osservato, che secondo lui è importante perché la sensibilità per rilevare un evento raro è proporzionale al volume totale del campione analizzato.Inoltre, "la lastra ad alta risoluzione ha ben 100.000 partizioni", ha affermato, aggiungendo che "le analisi corrispondenti su altri strumenti richiedono in genere più esecuzioni a costi maggiori".Infine, la facile integrazione nel sistema LIS è anche "un vantaggio critico" per i laboratori che eseguono analisi accreditate e lavorano secondo GLP o GCLP, ha affermato.Kubista ha affermato che è "semplice" progettare saggi personalizzati utilizzando il Digital LightCycler, "compresi saggi basati su progetti avanzati, come la PCR a due code che migliora la specificità e consente il rilevamento di bersagli molto più brevi".Per i servizi di test genetici dei portatori e molte applicazioni diagnostiche, questo attributo è fondamentale poiché i clienti spesso richiedono test personalizzati, ha affermato Kubista."Alcuni strumenti dPCR richiedono master mix complessi proprietari, il che complica la progettazione personalizzata per i fornitori di servizi", ha anche affermato.Il contenuto regolamentato e la standardizzazione saranno ora un fattore di differenziazione fondamentale tra gli strumenti dPCR, ha affermato Kubista, aggiungendo che sarà anche importante offrire soluzioni personalizzate basate su test convalidati per determinate applicazioni diagnostiche."Ci aspettiamo che [dPCR] rivoluzionerà diverse aree della diagnostica", ha affermato, anticipando le innovazioni nell'analisi del DNA senza cellule per il cancro, il rigetto dell'innesto e i test prenatali non invasivi, nonché nella medicina legale e nell'archeogenetica.E la PCR digitale è pronta a portare a scoperte nella ricerca biologica e a stimolare lo sviluppo dei test farmacodinamici e farmacocinetici necessari per far progredire la terapia cellulare e genica, ha osservato Kubista.Politica 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